通過連續(xù)成像實現(xiàn)新的分辨率提升

在慕尼黑路德維希-馬克西米利安大學(xué)（LMU），一個由物理學(xué)家Ralf Jungmann領(lǐng)導(dǎo)的研究小組正在利用一種新方法，將熒光顯微鏡的分辨率提高到埃斯特倫尺度--大大低于傳統(tǒng)光鏡的分辨率極限。

RESI可以使顯微鏡的長度尺度達到埃格斯特羅姆的分辨率，甚至可以達到DNA中兩個相鄰堿基之間的距離。圖片來源：Max Iglesias

LMU和馬克斯-普朗克生物化學(xué)研究所（MPIB）的Ralf Jungmann教授的研究小組能夠在熒光顯微鏡方面取得新的發(fā)現(xiàn)。該小組提出了 "序列成像分辨率增強法"（RESI），這是一種革命性的方法，可以將熒光顯微鏡的分辨率提高到?ngstr?m級別。

這一創(chuàng)造有望為研究生物系統(tǒng)的方法帶來范式的轉(zhuǎn)變，其細節(jié)迄今為止是無可比擬的。

眾所周知，細胞是生命的基本單位，由大量復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、過程和機制組成，支撐著生命系統(tǒng)并使之延續(xù)。一些細胞的核心成分，如RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，只有幾納米大小。

這使得它們與傳統(tǒng)光鏡的分辨率限制相比要小得多。因此，這類分子和結(jié)構(gòu)的正確組成和排列經(jīng)常是未知的，導(dǎo)致對生物學(xué)的基本概念缺乏機械性的理解。

在過去的幾年里，超分辨率方法創(chuàng)造了跨越式的發(fā)展，可以在經(jīng)典的光的衍射極限以下解決幾個亞細胞結(jié)構(gòu)。單分子定位顯微鏡，又稱SMLM，是一種超分辨率方法，有可能通過時間上隔離其熒光發(fā)射來解決10納米大小的結(jié)構(gòu)。

由于單個目標(biāo)在不同的黑暗視野中隨機地亮起（它們眨眼），它們的位置可以以亞分度的精度被識別。由Jungmann小組發(fā)明的DNA-PAINT是一種SMLM方法，它利用染料標(biāo)記的DNA "成像器 "鏈與它們的目標(biāo)結(jié)合的互補體進行瞬時雜交，以獲得超分辨率所必需的閃爍。但到目前為止，即使是DNA-PAINT也無法解析最小的細胞結(jié)構(gòu)。

RESI可以用任何標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡來應(yīng)用

在本研究中，由共同第一作者Susanne Reinhardt、Luciano Masullo、Isabelle Baudrexel和Philipp Steen與Jungmann共同領(lǐng)導(dǎo)的團隊啟動了超分辨率顯微鏡的新方法，從根本上實現(xiàn)了 "無限 "空間分辨率。

這種新方法被稱為 "通過連續(xù)成像提高分辨率"，簡稱RESI，它利用了DNA-PAINT的潛力，通過特殊的DNA序列對目標(biāo)進行編碼確定。

通過標(biāo)記相鄰的目標(biāo)，這些目標(biāo)相互之間太過接近，甚至無法用不同的DNA鏈進行超分辨率顯微鏡分析，一個額外的區(qū)分度（條形碼）已經(jīng)開始進入樣品。

通過依次對第一個序列和另一個序列（從而也是目標(biāo)）進行成像，它們可以被毫不含糊地分離出來。

最重要的是，由于它們是按順序成像的，目標(biāo)可以任意靠近，這是其他方法無法解決的問題。此外，RESI不需要專門的儀器，它可以在任何標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡的幫助下使用，從而使幾乎所有的科學(xué)家都能輕松地使用它。

為了說明RESI在分辨率上的飛躍，研究小組為自己設(shè)定了解決生物系統(tǒng)中最小的空間距離之一的困難： 單個堿基與DNA雙螺旋之間的隔離，其間隔不到1納米（十億分之一米）。

通過設(shè)計一個DNA折紙納米結(jié)構(gòu)，使其表現(xiàn)出從雙螺旋中以一個堿基對的距離伸出的單鏈DNA序列，并進一步對這種單鏈按順序成像，研究小組解決了相鄰堿基之間0.85納米（或8.5埃恩斯特倫）的距離，這是先前無法想象的壯舉。

科學(xué)家們完成了這樣的測量，其精確度為1埃恩斯特倫，或百億分之一米。這有助于強調(diào)RESI方法無可比擬的能力。

"生物研究的游戲規(guī)則改變者"

重要的是，該方法是通用的，不限于DNA納米結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。為此，該團隊分析了利妥昔單抗的分子作用模式，利妥昔單抗是一種抗CD20的單克隆抗體，最初于1997年被批準(zhǔn)用于治療CD20陽性血癌。

但是檢查這種藥物分子對分子受體模式的影響已經(jīng)超出了傳統(tǒng)顯微鏡方法的空間分辨率能力。理解這種模式是否以及如何改變健康和疾病以及治療時的情況，不僅對基本的機理研究有意義，而且對開發(fā)新的靶向疾病治療方法也有意義。

在RESI的幫助下，Jungmann和他的團隊能夠披露CD20受體在未經(jīng)處理的細胞中作為二聚體的自然排列，并揭示CD20如何在藥物治療后重新排列成二聚體鏈。目前，單蛋白水平的知識有助于深入了解利妥昔單抗的分子作用方式。

由于RESI是在完整的細胞中執(zhí)行的，該方法填補了X射線晶體學(xué)或低溫電子顯微鏡等純結(jié)構(gòu)方法與傳統(tǒng)的低分辨率全細胞成像方法之間的空白。

Jungmann和他的研究小組相信，"這種前所未有的技術(shù)不僅對超分辨率，而且對整個生物研究都是一種真正的游戲規(guī)則改變"。

參考資料：Reinhardt, S. C. M., et al. (2023) ?ngstr?m-resolution fluorescence microscopy. Nature. doi.org/10.1038/s41586-023-05925-9.