多光子顯微鏡技術(shù)之四十四 面向高散射和深成像的雙光子成像探針

細(xì)胞在發(fā)生大規(guī)模形態(tài)變化之前，首先在細(xì)胞水平引起代謝的變化。如果能夠識(shí)別細(xì)胞的代謝狀態(tài)，將有助于早期癌癥的診斷。雙光子自發(fā)熒光顯微成像能夠達(dá)到細(xì)胞水平分辨率，在早期宮頸癌的檢測(cè)中獲得令人鼓舞的結(jié)果，因此極大地促進(jìn)了手持式探頭的發(fā)展。較弱的自發(fā)發(fā)射熒光強(qiáng)度是阻礙雙光子自發(fā)熒光成像臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要挑戰(zhàn)，在臨床環(huán)境中組織散射和成像深度還會(huì)進(jìn)一步削減熒光強(qiáng)度。本文研制了一種獨(dú)特設(shè)計(jì)的成像探頭，在高散射和深成像條件下高效收集雙光子激發(fā)的熒光并對(duì)細(xì)胞代謝成像，有望在臨床環(huán)境中檢測(cè)早期宮頸癌[1]。

圖1 探頭的光學(xué)機(jī)械設(shè)計(jì)。a) 遠(yuǎn)端光學(xué)器件的側(cè)截面圖，顯示收集光纖的角度彎曲和端接。b) 遠(yuǎn)端光學(xué)器件的三維渲染視圖，收集光纖與物鏡由SLA印刷光纖支架（黃色）包圍。c) 探頭設(shè)計(jì)的側(cè)面截面圖。d) 工作距離(WD)恒定，通過(guò)軸向驅(qū)動(dòng)改變成像深度(ID) [1]

圖1展示了探頭的光學(xué)機(jī)械設(shè)計(jì)，前半部分為侵入性元件，主要用作探測(cè)，后半部分用來(lái)手持。由圖1(a)可知，探頭的前半部分由壓電致動(dòng)器管、激發(fā)光纖、物鏡組和收集光纖組成。其中，12根多模光纖(NA=0.5)以一定角度彎曲徑向排列在物鏡周圍，起收集自發(fā)發(fā)射熒光的作用，探頭的激發(fā)路徑與收集路徑完全獨(dú)立。

圖1(d)展示了如何改變成像距離（imaging distance, ID）對(duì)不同深度的組織成像。首先激光經(jīng)過(guò)物鏡組聚焦到樣品的距離(working distance, WD)是固定的，WD指的是物鏡表面到焦點(diǎn)的距離，ID是裝置外殼表面到焦點(diǎn)的距離。由圖1(c)可知，裝置的后半部分安裝有直流伺服電機(jī)，可以滿足6毫米軸向驅(qū)動(dòng)和亞微米運(yùn)動(dòng)分辨率。當(dāng)驅(qū)動(dòng)電機(jī)，電機(jī)產(chǎn)生的軸向驅(qū)動(dòng)力將通過(guò)裝置中的彈簧和滾珠傳遞到前端光學(xué)元件改變成像距離ID，從而對(duì)不同深度的上皮組織成像。在成像深度為50 um、光纖角度25°的條件下，作者比較了本文所采用的探頭設(shè)計(jì)方案與雙包層光纖(double cladding fiber，DCF)收集方案的收集效率。

DCF方案是指將纖芯用于傳輸激發(fā)脈沖，內(nèi)包層用于自發(fā)熒光收集。利用DCF采集自發(fā)熒光是一種常見(jiàn)設(shè)計(jì)方案，可以使收集元件與焦點(diǎn)軸向?qū)R，但是商用雙包層光纖的尺寸限制了總體可實(shí)現(xiàn)的收集面積，導(dǎo)致收集效率和成像深度受限。觀察DCF的收集路徑，雖然激發(fā)物鏡可以收集相當(dāng)大比例的發(fā)射光子(31.8%在前端)，但只有1.39%的光子可以到達(dá)DCF的二次包層。雖然本文探頭的每根收集光纖的收集效率僅為0.52%，但位于物鏡周圍的所有12根光纖加起來(lái)為6.24%。12根光纖與PMT的光陰極耦合，從而將收集的熒光傳遞到PMT。圖2展示了組裝完畢的探頭，組裝好的探針安裝在三軸平移臺(tái)上。鈦寶石激光器的可調(diào)波長(zhǎng)設(shè)置為775 nm，脈沖持續(xù)時(shí)間為100 fs，重復(fù)頻率為80 MHz，在實(shí)驗(yàn)中用作激勵(lì)源。

圖2 探頭的光機(jī)設(shè)計(jì) [1]

作者利用探頭在不同濃度的熒光素溶液中產(chǎn)生由雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光，并記錄由PMT、前置放大器和數(shù)據(jù)采集卡組成的讀出模塊獲取的電壓水平，并與臺(tái)式顯微鏡對(duì)比。圖3(a)的線性擬合的斜率表明，探頭系統(tǒng)的總體收集效率達(dá)到了顯微鏡所能提供的系統(tǒng)收集效率的55%。圖3(b)總結(jié)了系統(tǒng)不同部分的分析結(jié)果。圖3(c)展示了不同成像深度下的歸一化熒光衰減結(jié)果。圖3(d)的橙色線條是熒光強(qiáng)度隨FOV半徑的變化，藍(lán)色線條展示了在不同徑向位置測(cè)量到的物鏡漸暈導(dǎo)致的激發(fā)功率徑向降低，強(qiáng)度降低與功率平方曲線密切相關(guān)，表明收集效率的徑向依賴性較低。

圖3 探針的收集效率表征 [1]

圖4展示了探頭對(duì)花粉粒團(tuán)成像的結(jié)果，所有圖像的FOV均為120 μm，并為10幀圖像的平均值。這組圖像證實(shí)本文的探頭具有分辨精細(xì)特征的能力以及軸向掃描操作的穩(wěn)定性。

圖4 使用探頭以15 mW的平均激光功率照射樣品表面并軸向掃描，獲得的花粉粒團(tuán)不同軸向深度的雙光子圖像 [1]豬聲帶組織與宮頸組織的粘膜上皮非常接近，因此作者利用探頭對(duì)豬聲帶組織不同深度成像。從圖5可以看到，上皮層由具有明亮細(xì)胞質(zhì)和深色細(xì)胞核特征的鱗狀細(xì)胞構(gòu)成，在成像深度約50 μm以下的淺層固有膜中，纖維膠原層讓位于上皮層。

圖5 探頭在切除的豬聲帶組織樣本中不同成像深度獲得的自發(fā)熒光圖像 [1]

總之，本文提出一種適用于自發(fā)熒光收集的探頭設(shè)計(jì)方案，能夠在深成像和高散射情況下具有較高的收集效率。這種探頭如果能應(yīng)用于臨床，將有可能在早期癌癥檢測(cè)方面實(shí)現(xiàn)重大突破。

參考文獻(xiàn)：

[1] Berk Camli, Liam Andrus, Aditya Roy, Biswajit Mishra, Chris Xu, Irene Georgakoudi, Tomasz Tkaczyk, and Adela Ben-Yakar, "Two photon imaging probe with highly efficient autofluorescence collection at high scattering and deep imaging conditions," Biomed. Opt. Express15, 3163-3182 (2024)

原文標(biāo)題:多光子顯微鏡技術(shù)之四十四 面向高散射和深成像的雙光子成像探針